(Průtoková cytometrie, FCM) je buněčný analyzátor, který měří intenzitu fluorescence obarvených buněčných markerů. Jedná se o high-tech technologii vyvinutou na základě analýzy a třídění jednotlivých buněk. Dokáže rychle měřit a klasifikovat velikost, vnitřní strukturu, DNA, RNA, proteiny, antigeny a další fyzikální nebo chemické vlastnosti buněk a může být založena na shromažďování těchto klasifikací.
Průtokový cytometr se skládá hlavně z následujících pěti částí:
1 Průtoková komora a fluidní systém
2 Zdroj laserového světla a systém tvarování paprsku
3 Optický systém
4 Elektronika, systém pro ukládání, zobrazování a analýzu
5 Systém třídění buněk
Mezi nimi je hlavním měřením fluorescenčních signálů v průtokové cytometrii laserová excitace v laserovém světelném zdroji a systému pro formování paprsku. Intenzita excitačního světla a doba expozice souvisí s intenzitou fluorescenčního signálu. Laser je koherentní zdroj světla, který dokáže poskytnout osvětlení s jednou vlnovou délkou, vysokou intenzitou a vysokou stabilitou. Je ideálním excitačním zdrojem světla, který splňuje tyto požadavky.
Mezi laserovým zdrojem a průtokovou komorou jsou dvě válcové čočky. Tyto čočky zaostřují laserový paprsek s kruhovým průřezem vyzařovaný z laserového zdroje do eliptického paprsku s menším průřezem (22 μm × 66 μm). Laserová energie v tomto eliptickém paprsku je rozložena podle normálního rozdělení, což zajišťuje konzistentní intenzitu osvětlení buněk procházejících oblastí laserové detekce. Optický systém se na druhou stranu skládá z několika sad čoček, otvorů a filtrů, které lze zhruba rozdělit do dvou skupin: před a za průtokovou komorou.
Optický systém před průtokovou komorou se skládá z čočky a dírky. Hlavní funkcí čočky a dírky (obvykle dvou čoček a jedné dírky) je zaostřit laserový paprsek s kruhovým průřezem vyzařovaný laserovým zdrojem do eliptického paprsku s menším průřezem. Tím se laserová energie rozdělí podle normálního rozdělení, čímž se zajistí konzistentní intenzita osvětlení buněk v celé oblasti detekce laseru a minimalizuje se rušení rozptýleným světlem.
Existují tři hlavní typy filtrů:
1: Dlouhoprůchodový filtr (LPF) – propouští pouze světlo s vlnovými délkami vyššími než specifická hodnota.
2: Krátkopropustný filtr (SPF) – propouští pouze světlo s vlnovými délkami pod určitou hodnotou.
3: Pásmový filtr (BPF) - propouští pouze světlo v určitém rozsahu vlnových délek.
Různé kombinace filtrů mohou směrovat fluorescenční signály o různých vlnových délkách do jednotlivých fotonásobičů (PMT). Například filtry pro detekci zelené fluorescence (FITC) před PMT jsou LPF550 a BPF525. Filtry používané pro detekci oranžovo-červené fluorescence (PE) před PMT jsou LPF600 a BPF575. Filtry pro detekci červené fluorescence (CY5) před PMT jsou LPF650 a BPF675.
Průtoková cytometrie se používá hlavně pro třídění buněk. S pokrokem počítačové technologie, rozvojem imunologie a vynálezem technologie monoklonálních protilátek se její aplikace v biologii, medicíně, farmacii a dalších oblastech stávají stále rozšířenějšími. Mezi tyto aplikace patří analýza buněčné dynamiky, apoptóza buněk, typizace buněk, diagnostika nádorů, analýza účinnosti léčiv atd.
Čas zveřejnění: 21. září 2023
